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500ml三角瓶中培养基装液量为100ml
发表日期:2019-10-05 15:43| 来源 :本站原创 | 点击数:
本文摘要:培养基配比可将该菌株的虫草素含量提高到1.21%,比用Czapek培养基提高8.1倍。柴建萍等通过实验得出玉米粉为最优碳源,蚕蛹粉为最优氮源,MgSO 凝集素能够促进血细胞凝集和复合糖沉淀,被用 于 复 合 糖 的 检 测 定 位 和分离研究。SDS -PAGE 电泳表明蛹虫

  培养基配比可将该菌株的虫草素含量提高到1.21%,比用Czapek培养基提高8.1倍。柴建萍等通过实验得出玉米粉为最优碳源,蚕蛹粉为最优氮源,MgSO

  凝集素能够促进血细胞凝集和复合糖沉淀,被用 于 复 合 糖 的 检 测 定 位 和分离研究。SDS -PAGE 电泳表明蛹虫草凝集素的分子量大小为31. 0 kDa,在凝胶层析柱 Superdex - 200 HR 的峰值是 31. 4 kDa。蛹虫草凝集素的凝血活性能被唾液糖蛋白类所抑制,但单糖和二糖、无唾液酸糖蛋白和乙酰醣蛋白却没有抑制作用。Wong 等 获得蛹虫草分子量大小为 30 kDa 的凝集素,这一凝集素在低于 60℃ 时具有稳定的凝血作用。

  (6)鉴定优良菌种标准是:菌丝白色,粗壮浓密,呈匍匐状紧贴培养基生长,边缘整齐,无明显绒毛状白色气生菌丝,后期分泌黄色色素,菌丝见光后变为橘黄色。将分离菌种进行扩大培养后,接种在米饭培养基上进行出草和鉴定。于18℃-20℃温度下培养20-30天,如果无污染则继续培养,l个月后即可形成橙红色子实体。经鉴定种性,选择性状优良菌种用于生产。

  (1)选革选择生长正常、健壮、无病虫害的新鲜蛹虫草做分离材料。用野生早期生长(8月底以前出土的)蛹虫草分离得到的蛹虫草菌种具有明显早熟性(即早出草)。菌种分离可采用泡子分离或组织分离等方法,生产上常用组织分离获得纯菌种或进行菌种复壮。

  蛹虫草 - 形态特征子座单生或数个一起从寄生蛹体的头部或节部长出,颜色为橘黄或橘红色,全长2-8厘米,蛹体颜色为紫色,长约1.5-2厘米。

  通过丙酮抽提和硅胶柱层析纯化,获得蛹虫草类胡萝卜素的 3 个光谱吸收峰分别为 416 nm、439 nm 和 468 nm,该类胡萝卜素在蛹虫草中随时间变化但有一个产量的高峰期,其最高产量可达472. 3 μg /g 。蛹虫草在光照条件下培养,其菌落呈橙黄色,菌丝体中类胡萝卜素含高量 。

  (4)选择抑菌培养基分离培养基最好采用加有50毫克/升链霉素的加富培养基。如采用其他培养基进行分离,在培养基中加入一定量的抑菌剂会提高分离效果。常用抑菌剂使用量和加入方法如下:链霉素 30-50毫克/升,灭菌后冷却至 45℃时加入;金霉素 20-30毫克/升,灭菌后冷却至 45℃时加入;青霉素 20毫克/升,灭菌后冷却至 45℃时加入;牛胆汁 5克/升,配制时加入;孟加拉红 35毫克/升,培养基煮沸时加入。

  (3)分离先用解剖刀切去虫体外部,避开肠道,然后切取内部白色组织块或子座内的组织块,接种到斜面母种培养基上。以蛹虫草子实体有龟背状花纹的顶端组织获得菌种种性最好。

  超氧化歧化酶的存在与生物体抗衰老、抗肿瘤、营养状况、免疫性疾病、炎症及辐射防护有关。超氧化歧化酶是蛹虫草的活性成分之一,获得的 超 氧 化 歧 化 酶 ( cm - SOD) 的 分 子 量 为15. 7 kDa,且含有铜和锌元素; 纯化后的蛹虫草超氧化物歧化酶对热比较稳定,最适 pH 为 7. 8,在pH 值为 7 ~ 8 范围内 SOD 的酶活性比较稳定,且活力最大 。

  蛹虫草发酵的适宜培养基组成为:蔗糖5.0%,玉米浆3.0%,酵母膏0.5%,MgSO

  优选品种→制备培养基→蛹虫草母种→二级菌种(药瓶)→栽培蛹虫草菌种→控制环境温度与湿度→采收。

  冬天是虫,夏天是草,冬虫夏草是个宝。如果你家有老人,你肯定对这个广告不陌生。而作为一个威士忌里加党参,啤酒杯里泡枸杞的养生穷人,阻止我们把它泡进大米粥里的唯一原因可能就是因为它——实在贵得要命。那……蛹虫草了解一下?蛹虫草(图...

  (6)人工培植的蛹虫草比天然生长的冬虫夏草有效成分更高。野生虫草和人工虫草在化学成分上是完全一致的,只是含量上有所差异。人工培植的蛹虫草大多超过天然生长的冬虫夏草。经科学实验分析证明,冬虫夏草对人体健康的意义是其含有特有的药用和保健作用的物质:虫草素、虫草酸、虫草多糖和丰富的蛋白质、氨基酸、微量元素、维生素等。经中国科学院理化分析测试实验室化验报道,具有虫草代表性的4种主要药理成分:虫草素、虫草酸、虫草多糖和SOD酶,人工蛹虫草与野生冬虫夏草相比,除了虫草酸略低于野生虫草外,其余均明显高于野生虫草。虫草多糖高2倍,SOD酶高5倍,虫草素高达89倍。

  (L.ex Fr.) Link. 蛹虫草,又叫北冬虫夏草,北虫草,简称蛹草,一般把活体虫蛹培养的北虫草称为蛹虫草,两者是同种真菌,但在营养成分上含量相差较大。

  中医认为,既能补肺阴,又能补肾阳,主治肾虚,阳痿遗精,腰膝酸痛,病后虚弱,久咳虚弱,劳咳痰血,自汗盗汗等,是一种能同时平衡、调节阴阳的中药。

  维生素:虫草菌丝不能合成必要的维生素,适当加入VB1有利于菌丝的生长发育。

  现代医学证明多糖具有抗肿瘤作用,同时具有抗衰老、抗氧化、抗凝血、降血糖、降血脂等

  。胞外多糖最佳发酵工艺参数:初始pH值为7,500ml三角瓶中培养基装液量为100ml,接种量6%,温度28°C。周期为96h。

  蛹虫草为偏酸性真菌,其菌丝生长发育最适pH为5.2-6.8。但在灭菌和培养过程中pH值要下降。所以在配制培养基时,应调高pH值1-1.5,在配制培养基时可加0.1%-0.2%的磷酸二氢钾或磷酸氢二钾等缓冲物质。

  (5)培养分离接种后,在 20℃恒温箱内培养 10天左右,挑选性状良好的母种作为菌种。

  蛹虫草菌丝的生长可以利用多种碳源和氮源,在以红糖碳源、奶粉为氮源的液体培养基中生长最佳,且碳源/氮源合适的比例为2.0~2.5/1.0,适宜PH为5.0~6.5。

  氮源:氮元素是蛹虫草自身合成的蛋白质、核酸等有机氮以及铵盐等无机氮。能利用的有机氮很多,如氨基酸、蛋白胨、豆饼粉、蚕蛹粉等;无机氮主要有氯化铵、硝酸钠、磷酸氢二铵等。有机氮的利用效果最好。

  为最优无机盐。液体发酵最佳培养基配方为:玉米粉(20g/1000ml),蚕蛹粉(5g/1000ml),硫酸镁(0.5g/1000ml)。

  麦角甾醇是真菌的特征醇,在蛹虫草中的含量相对恒定,在一定程度上能反映药材的质量,可作为人工蛹虫草子实体质控指标之一。麦角甾醇具有抗癌、抗病毒、防 心 率 不 齐、减 毒 等 功 能。HPLC 法可测定蛹虫草麦角甾醇的含量,蛹虫草中麦角 甾 醇 的 含 量 平 均 为 0. 687%。不同产地和来源的人工蛹虫草子实体中游离麦角甾醇的含量存在一定的差异,在 0. 39% -0. 82% 之间 。

  (2)营养载体不同。天然冬虫夏草以自然虫体或蛹体营养为基础,人工培植的北冬虫夏草有多种培养基为基础。营养载体不同影响虫草菌的最终物质的形成,北冬虫夏草的人工培育,主要有两类,一类是小麦、大米等谷类,二是跟野生蛹虫草一样,采用蛹体为基础,虽然它们是一样的菌种,但最终在有效成分的含量上相差很大,蛹体是远大于小麦、大米等,因此在价格上也有较大的差别。

  将母种扩大培养后,置米饭培养基上,于18℃-20℃下培养20-30d,观察生长情况。若见有细菌或霉菌污染,应对母种进一步纯化;若无杂菌污染,可继续培养,一个月后即有橙红色子实体产生,说明母种可靠。

  (4)生产周期不同。由于受恶劣自然环境影响,天然冬虫夏草在自然环境中生长周期为2-3年,主要是寄生体(虫体)世代繁殖生育期较长以及虫草菌受恶劣自然环境影响生长缓慢。人工培植的蛹虫草菌在优裕的生长环境中生产,即人工控制最适宜生长条件以及在稳定的生长环境中不受自然环境的影响,2个月内就可以生产一批,大大提高了生产效率。

  矿质元素:以磷、钾、钙、镁等为主要元素。一般通过添加无机盐类来满足蛹虫草对矿质元素的需求。

  (5)对环境影响不同。天然冬虫夏草菌在自然环境中生长非常缓慢,跟不上市场与人们需求的需要。人们大量采挖天然冬虫夏草,破坏了自然植被,也破坏了自然环境和资源。人工培植的蛹虫草,在室内进行生产,没有任何破坏自然植被、自然环境和资源的行为,而且在生产过程中没有任何产物会污染环境。

  纯化的类胰岛素蛋白 P- 1 - 1 通 过 SDS -PAGE 电泳检测为 23. 4 kDa 的单一条带,酶活性的最佳 pH 值范围是 8. 5- 12. 0。这个蛋白能被亮肽素和氟代磷酸二异丙酯强烈抑制,也能被 a-对甲苯磺酰- L - 赖氨酸氯甲基酮盐 ( TLCK) 、苯甲基磺酰氟化物 ( PMSF) 和糜蛋白酶抑制剂抑制。

  接种后的料瓶,应置于清洁、避光的环境中培养,保护空气湿度60%。初始阶段,为减少杂菌污染,室内温室宜保持在15℃-18℃之间,待料面布满虫草菌丝后,将温度提到20℃-23℃,持续15d左右,菌丝即可吃透培养料,完成营养生长。

  碳源:蛹虫草合成碳水化合物和氨基酸的基础,也是重要的能量来源。人工栽培时,蛹虫草可利用的碳源有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、果胶等,其中尤以葡萄糖、蔗糖等小分子糖类的利用效果最好。

  发酵最佳培养基组成是:5%大米粉、1.5%豆饼粉、1.5%麦芽粉、0.1%KH

  一般当蛹虫草的菌丝把蛹体内的各种组织和器官分解完毕后,菌丝体发育也进入了一个新的阶段。形成橘黄色或橘红色的顶部略膨大的呈棒状的子座(子实体)。

  虫草中腺苷成分含量不能代表虫草特有的药用和保健价值,其原因是腺苷在香菇、蘑菇等几十类真菌植物中都有存在。因此,把腺苷作为质量指标是“贬低”了虫草的特有价值,不能体现虫草防病治病的特有奥秘。

  硒(Se):为国际医学界公认的抗癌元素,也是重要的抗氧化剂,能增强人体免疫力。

  超氧化物歧化酶(SOD):抑制或消除催人衰老的超氧自由基形成及抗癌、防衰、减毒。

  作用,能提高免疫力,改善肝功能,延缓衰老等。蛹虫草多糖组成的具体基本单位及结构对深入了解虫草多糖有重要意义。利用高效阴离子交换 - 脉冲安培检测色谱法分别对P50、P70 - 1、P70-2、CBP-1、CBP-2 和 CBP-3 等 6 种精多糖的单糖组成成分进行了测定,结果除 CBP- 3 为葡聚糖外,其他 5 个多糖均为由 D- 甘露糖、D-半乳糖和 D -葡萄糖组成的杂多糖。

  将液体培养基分装于500ml三角瓶中,每瓶加培养液200ml,用12层纱布外加一层牛皮纸封口。13-30分钟灭菌后,将母种在无菌条件下用接种钩接入三角瓶中,每支斜面可接10瓶以上。接种后于20℃摇床培养5d左右,待形成均匀小球后即可用于栽培种。

  蛹虫草需要少量空气。但在子实体发生期要适当通风,增加新鲜空气。否则,二氧化碳积累过多,子座不能正常分化,影响生长发育。

  长期采用无性繁殖及多次转管的蛹虫草菌种,其母本基因容易变异,表现为出草畸形,产质量下降。因此,在生产中应定期对蛹虫草菌种进行一次有性繁殖。具体做法是,选取高产、优质、早熟的蛹虫草子实体,用0.1%升汞溶液,或75%的酒精进行表面消毒后,用无菌水清洗表面药液,置于盛有综合培养基容器上方悬空,在21℃-23℃下静置培养,待培养基表面出现星芒状虫草菌落时,在接种箱内挑取单个或多个菌落置试管斜面培养基培养。待蛹虫草菌丝布满斜面后再提纯。获得的孢子母种须经出草比较试验后,选取优质虫草子实体再进行一次组织分离,经筛选后方可用于转扩栽培种。

  菌丝体成熟后,由白色逐渐转为桔黄色,此时,室内应增加光照白,白天利用自然散射光,保持200勒克斯,晚间可利用日光灯作光源,每天应不少于10h光照,以促使菌丝体转色和刺激原基形成。待料面突起,并形成小米粒状原基时,要适当通风,补充新鲜空气,保护室内温度18℃-22℃,并提高空气相对温度至80%-85%。如湿度太大,易使培养基提早失水而影响产量。蛹虫草有较强的趋光性,因此在子实体形成后,应根据情况适当调整培养瓶与光源的相对方向,或调整室内光源方向,以保证子实体的正常生长形态,从而提高产量,形成橘黄色或橘红色的顶部略膨大的呈棒状的子座(子实体)。待子实体不再生长,其顶端出现许多小刺时,表明已成熟。采收时,用无菌镊子钳出子实体,然后再加少许营养液,重新包扎好瓶口,继续培养,20d左右,又可长出第二批子座。采收下的子实体晾干或低温烘干后出售。暂不出售,应密封好置低温干燥处贮存。

  虫草素(3′-脱氧腺苷):抗病毒、抗菌、明显抑制肿瘤生长、干扰人体RNA 及DNA合成。

  天然蛹虫草资源稀少,人工固体栽培周期长,也不易控制条件。通过液体深层培养法获得虫草菌丝体丝体的化学组成与从天然采集的虫草的化学组成接近,而且可以从发酵液中得到人们需要的物质,还能大大缩短生产周期。

  水分是蛹虫草菌体细胞的重要组成部分。菌丝生长阶段,培养基含水量保持在60%-65%,空气相对湿度保持在60%-70%;子实体生长阶段,培养基含水量要达到65%-70%,空气相对湿度保持在80%-90%。要注意培养基适时补水和补充营养液。

  以大米、玉米等作主料,另添加10%-25%的蚕蛹粉或奶粉妈提高蛹虫草子实体的品质。将培养料与营养液以1:1比例拌匀,pH值掌握在5.5-7.0。按常规装瓶、灭菌、接种。

  腺苷:抗病毒、抗菌,预防治疗脑血栓、脑溢血 ,抑制血小板积聚防止血栓形成,消除面斑,抗衰防皱。

  0.15%,VB15mg/L,2,4D2mg/L。在相同条件下,优化培养基比原来培养基的发酵得率提高了4.5%,研究初步得到蛹虫草液体培养条件和生长动力学,为工业化生产提供了一定的理论依据。

  蛹虫草是一种子囊菌,通过异宗配合进行有性生殖。其无性型为蛹草拟青霉。其子实体成熟后可形成子囊孢子(繁殖单位),孢子散发后随风传播,孢子落在适宜的虫体上,便开始萌发形成菌丝体。菌丝体一面不断地发育,一面开始向虫体内蔓延,于是蛹虫就会被真菌感染,分解蛹体内的组织,以蛹体内的营养作为其生长发育的物质和能量来源,最后将蛹体内部完全分解。

  孢子萌发和菌丝生长阶段不需要光照,应保持黑暗环境。但转化到生殖生长阶段需要明亮的散射光,光照度为100-240勒(勒为光照度单位)。光照强,菌丝色泽深,质量好,产量高。

  分布于云南(昆明安宁江川)、吉林(安图、永吉)、辽宁(沈阳)、内蒙古(哲里木盟)。

  虫草多糖和SOD等多种生物活性物质的药用价值最为显著。虫草酸(甘露醇)可以显著地降低颅压,促进机体新陈代谢,因而使脑溢血和脑血栓病症得到缓解。虫草素是一种具有抗菌活性的核苷类物质,对核多聚腺苷酸聚合酶有很强的抑制作用。在DNA转录mRNA过程中使mRNA成熟障碍,抑制癌细胞的生长。并有降血糖的作用。虫草多糖是一种高度分枝的半乳甘露聚糖,它能促进淋巴细胞转化,提高血清IgG的抗体含量和机体的免疫功能,增强机体自身抗癌抑癌的能力。SOD(超氧化物歧化酶)可以消除机体内超氧自由基,具有抗衰老、抗癌抑癌的作用。此外,蛹虫草还含有丰富的硒(Se),这种微量元素已被大家公认是人体必需的微量元素,是谷胱甘肽过氧化酶的活性中心,以硒半胱氨酸的形式连接在酶蛋白的肽链上,保护细胞膜的稳定性的正常的通透性,并刺激免疫球蛋白和抗体的产生,增强机体免疫和抗氧化能力。同时,大量的科学实践证明硒可以明显地抑制癌细胞的生长。

  天然野生北冬虫夏草始载于《新华本草纲要》,其“味甘,性平”,有“益肺肾、补精髓,止血化痰”的功效。现代中医学巨著《中华药海》记载:“蛹草,别名北冬虫夏草(吉林),性味甘、平,入肺、肾二经。功效主治:1.益肾补阳,本品甘平,补肾阳,益精髓,用治肾阳不足,髓海空虚,眩晕耳鸣,健忘不寐,腰膝酸软,阳痿早泄等症。2.止血化痰,本品即补肾阳,有益肺阴,保肺益肾,秘经益气,对肺肾不足、久咳虚喘、劳嗽痰血者有较好疗效”。此外《全国中草药汇编》记载:“蛹虫草(北虫草)的子实体及虫体也可作为冬虫夏草入药”.

  影响蛹虫草菌胞外多糖产量的实验因子显著性大小的排列顺序为:甜菜糖;酵母浸出粉KNO

  黄酮类化合物在自然界中分布广泛,具有抗氧化、抗癌、抑制脂肪氧化酶、防治心脑血管疾病等方面的功效 。利用乙醇回流法提取蛹虫草黄酮类化合物的最佳条件业已建立 。

  虫草酸,为虫草类真菌中的主要有效成分之一,具有利尿脱水、提高血浆渗透压、镇喘祛痰、抗自由基等药理作用。蛹虫草的虫草酸含量目前一般使用用高碘酸钠法进行比色测定 。不同碳氮源培养液对蛹虫草虫草酸含量的影响较大,虫草酸含量以麦米蛹配方最高,每 1mL 培养液虫草酸含量最高达 4. 94 mg,最低 0. 09 mg。

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  值得注意的是:如果培养液变混,有两种可能性,一是细菌污染应予以淘汰;二是由于菌丝生长过分粘稠所致。若难以判断,可进行镜检。

  (3)生长环境不同。天然虫草菌生长在自然环境中,这种自然环境是特定的,不是随心所欲的。人工培植的蛹虫草生长在人为的环境中,这种人为环境是根据虫草生长的特定自然环境而设定,不过比自然环境更优裕,从而使虫草菌生长得更好、产量更高。

  0.05%,接种量3%,pH5.5。认为碳源因子对胞外多糖的产生影响显著。

  虫草菌丝的最适生长温度为20~25°C。在进行菌丝发酵时碳源以蛋白胨为最优,采用1∶2或1∶3的碳氮比较为合适。

  虫草含丰富的蛋白质和氨基酸。很多具有生物活性的蛋白质可以在实验动物或人体中发挥重要的调节作用,分离纯化虫草中的活性蛋白质成分,以期找到一些新的具有临床应用价值的蛋白质或多 肽,已成为研究的一个重要方向。蛹虫草的多肽 cordycepeptide A 及冬虫夏草的一些多肽都表现出抗癌和免疫增强作用。具有重要功效的多肽不断被发现,例如蛹虫草多肽 Cordymin 具有抗真菌作用 ,而蛹虫草蛋白 CMP 具有抗真菌和抗癌作用 。虫草微量元素研究报道很多,一般认为虫草中含有丰富的微量元素,已检出 30 多种元素,人体必需元素含量高。硒为微量元素中的抗癌之王,对砷、汞、镉等重金属有解毒作用,蛹虫草中硒的含量十分丰富含硒量达到 92. 3 mg /kg 。

  (1)形状不同。天然虫草是冬虫夏草的虫体或蛹体与虫草菌的子实体(草的部分)合二为一体的整体,而虫草花仅仅是北冬虫夏草的子实体,在外观上与天然冬虫夏草有很大区别,但是还是有不少商人打着蛹虫草的名义去卖虫草花,其营养价值和一般大型真菌(如蘑菇,金针菇等)没有太大的差别。真正的蛹虫草是含有虫体的,没有虫体的就是虫草花。

  蛹虫草世界性分布,天然资源数量很少。1950年,德国科学家Cunningham观察到被蛹虫草寄生的昆虫组织不易腐烂,进而从中分离出一种抗菌性物质,3-脱氧腺苷,定名为虫草素。蛹虫草,多感染鳞翅目昆虫的蛹,由子座(即草部分,又称子实体)与菌核(即昆虫的尸体部分)两部分组成的复合体,简单来说,就是虫体与草的结合。

  核苷类物质为虫草的主要活性成分之一,具有广泛的生理功能。目前蛹虫草核苷包括虫草素、腺苷腺嘌呤尿嘧啶尿苷鸟嘌呤次黄嘌呤核苷胸腺嘧啶等。虫草素又称虫草菌素或 3- 脱氧腺苷 ( Cordycepin 或 3- Deoxyadenosine) ,具有抑菌、抗病毒等生物活性,表现出免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、扩张支气管、显著增强肾上腺素等药理作用功能 。蛹虫草发酵菌丝体虫草素的含量远远高于冬虫夏草。虫草素价格非常昂贵,能以腺苷、3 -O - 对硝基苯磺酰基腺苷等为原料进行化学合成 。

  (2)消毒将鲜蛹虫草用清水洗去外表泥土,再用0.1%升汞水溶液消毒1-3分钟,用无菌水冲洗数次,然后再用75%酒精浸泡3-5分钟,用无菌水洗净后进行分离。

  微生物的纤维蛋白溶解酶安全性好,生产成本较低,且可经过胃肠道吸收,有望开发成预防或治疗心血管疾病的新一代口服溶栓药物。从蛹虫草中通过 SDS - PAGE 电泳、纤维蛋白酶谱和凝胶过滤层析法检纯化的蛋白,其分子量为 52. 0 kDa,蛋白 N 末端的前 19 个氨基酸为 ALTTQSNVTHGLATISLRQ,与金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae 的类枯草杆菌蛋白酶 PR1J 相似。这个纤维蛋白溶解酶的最佳酶活 pH 值和温度分别为7. 4 和37℃ 。而另一报道获得的纤维蛋白溶解酶分子量为 27. 3 kDa,最佳酶活 pH 值和温度分别为 6. 0 和 25℃。Mg和Fe促进酶活,EDTA 和 Cu抑制酶活。

  在虫草的不同生长发育阶段都有最适温度、最低温度和最高温度的界限。菌丝生长温度6℃-30℃,低于6℃极少生长,高于30℃停止生长,甚至死亡。最适生长温度为18℃-22℃;子实体生长温度为10℃-25℃,最适生产温度为20℃-23℃。原基分化时需较大温差刺激,一般应保持5℃-10℃温差。

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